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        質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題分析

        更新時(shí)間:2010-10-24  |  點(diǎn)擊率:8730

         

        質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題分析
         

        常見(jiàn)問(wèn)題
        可能原因
        建議解決方案
        未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低
        大腸桿茵老化
        請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后,重新挑選新茵落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
        質(zhì)??截悢?shù)低
        由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低,可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
        菌體中無(wú)質(zhì)粒
        有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在,經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如,柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(zhǎng)期保存不穩(wěn)定,因此不要頻繁轉(zhuǎn)接,每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外,檢查篩選所用抗生素種類和工作濃度是否正確。
        堿裂解不充分
        使用過(guò)多的菌體培養(yǎng)液,會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分,此時(shí)可減少菌體用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒,提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2和P3,可能有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。
        溶液使用不當(dāng)
        溶液P2和P3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁,應(yīng)置于37℃保溫一段時(shí)間,直至溶液變?yōu)榍辶梁蟛拍苁褂谩?/div>
        質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))
        洗脫溶解質(zhì)粒時(shí),可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。
        洗脫液加入位置不正確
        洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位,確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達(dá)到大洗脫效率。
        洗脫液不合適
        DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫,如TE和水;洗脫液pH值過(guò)低會(huì)降低洗脫效率,應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間,當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi);洗脫時(shí)可將洗脫緩沖液在65-70水浴預(yù)熱,加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘,可提高洗脫效率。
        洗脫體積太小
        洗脫液體積若小于30μl,則不易*浸透硅膠膜,使洗脫效率降低;洗脫液體積若超過(guò)200μl,則所得的DNA濃度會(huì)降低,但DNA總量不會(huì)減少。為了得到較高的洗脫效率可以適當(dāng)增大洗脫液體積。
        洗脫時(shí)間過(guò)短
        洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有—定影響,洗脫時(shí)放置2分鐘可達(dá)到較好的效果。
        堿裂時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
        加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘。
        質(zhì)粒純度不高
        混有蛋白
        菌體不要過(guò)量。經(jīng)溶液P1、P2和P3處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的,如果還混有微小蛋白懸浮物,可再次離心去除。
        混有RNA
        RNase A處理不*,請(qǐng)減少菌體用量或加入溶液P3后室溫放置一段時(shí)間。若溶液P1已保存6個(gè)月以上,請(qǐng)?jiān)谌芤篜1中添加RNaseA。
        混有基因組DNA
        加入溶液P2和P3后應(yīng)溫和混勻,如果劇烈振蕩,可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液P2后過(guò)于粘稠,無(wú)法溫和混勻,請(qǐng)減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解,培養(yǎng)時(shí)間不要超過(guò)16小時(shí)。
        含大量核酸酶的宿主菌
        宿主菌含大量核酸酶,在質(zhì)粒提取過(guò)程中降解質(zhì)粒DNA,影響提取質(zhì)粒DNA的完整性,好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌,如DH5α和*0。
        質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式
        是在質(zhì)粒復(fù)制過(guò)程中形成的,與宿主菌相關(guān),電泳可檢測(cè)出多條條帶,單酶切處理后可變成單一條帶。
        乙醇?xì)埩?/div>
        漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除柱中殘留液體,并晾干吸附柱。如果DNA已經(jīng)洗脫出來(lái),可以用酒精沉淀DNA并風(fēng)干,然后再溶解。

         

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